2017年1月24日，清華大學(xué)譚旭研究組與美國俄亥俄州立大學(xué)董一洲研究組合作在《Cell Research》上發(fā)表了題為《A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutic gene targeting in vivo》，在國際上首先研發(fā)出一種新型CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)，其能夠在體內(nèi)遞送CRISPR/Cas9至肝臟，并在單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA)的引導(dǎo)下靶向切割外源或內(nèi)源致病基因從而達(dá)到治療肝病的目的。該種新型遞送系統(tǒng)為CRISPR/Cas9這一強有力的基因編輯工具，在臨床上的實際應(yīng)用開辟了新途徑。

　　自上個世紀(jì)90年代以來，基因治療逐漸興起，其通過補償基因缺陷或修正異常致病基因從而達(dá)到治療的目的。CRISPR/Cas9是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種DNA剪編輯系統(tǒng)，由于其高效特異的DNA剪切和編輯能力在科研領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，而在臨床治療中其應(yīng)用前景也非常值得期待。已有的CRISPR/Cas9體內(nèi)輸送是通過運用腺病毒表達(dá)體系來表達(dá)Cas9和guide RNA，如同腺病毒在基因治療歷史中的巨大作用一樣，但也存在諸如腺病毒缺乏靶向性，本身免疫源性較高，病毒在體內(nèi)有一定重組突變機率等問題。而且，腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的長期穩(wěn)定表達(dá)Cas9 DNA酶，也有可能帶來長期的毒副作用。

　　基于脂質(zhì)納米顆粒的核酸輸送系統(tǒng)已經(jīng)在活體內(nèi)輸送小RNA，如siRNA上表現(xiàn)出良好的效果。譚旭課題組與董一洲研究組合作研發(fā)了一種新型脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)，其可以包裹Cas9蛋白的mRNA以及單鏈引導(dǎo)RNA并在活體內(nèi)有效的輸送至肝臟并進行表達(dá)，對特定致病基因進行切割。

　　為測試所研發(fā)的新型脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)的實際效果，研究組分別選取了以下一個外源性靶點和一個內(nèi)源性靶點進行測試。選擇的外源性靶點是乙肝病毒（HBV）基因組。全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，而在中國更是一個嚴(yán)重的社會問題。乙肝病毒難以徹底清除的主要原因是其基因組以一種共價閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA或cccDNA)形式存在，而現(xiàn)有治療手段均無法觸及cccDNA；選擇的內(nèi)源性靶點是前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9， PCSK9）是當(dāng)前針對高膽固醇血癥和其它心血管疾病藥物研發(fā)的重要靶點。就目前來看，針對PCSK9的藥物主要是抗體類藥物，需要長期多次服用，價格昂貴。上述二者均有希望通過編輯其基因序列而達(dá)到治療的目的，故研究組選取此二者為對象，測試這種新型的藥物遞送系統(tǒng)。

　　研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平上，經(jīng)這種新型脂質(zhì)納米顆粒（LNP）包裹的Cas9/sgRNA，能夠有效的對細(xì)胞中HBV cccDNA和Pcsk9基因進行切割，并有效的降低HBV相關(guān)抗原的表達(dá)。動物實驗結(jié)果表明，這種新型脂質(zhì)納米顆粒可以有效遞送Cas9/sgRNA輸送至肝臟進行表達(dá)，并且尾靜脈注射6小時后Cas9蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，其后逐步降低，24小時后消失。在肝臟內(nèi)，所遞送的Cas9/sgRNA能對內(nèi)外源基因序列進行有效的特異性剪切，進而降低相關(guān)蛋白的表達(dá)量。一次注射能有效降低乙肝病毒表達(dá)量50％以上。國際審稿人認(rèn)為這項工作是本領(lǐng)域激動人心的成果，對CRISPR/Cas9系統(tǒng)未來的臨床轉(zhuǎn)化研究有重要意義。該研究成果以通訊形式于2017年1月24日在線發(fā)表于《Cell Research》上。

　　論文通訊作者為譚旭和董一洲。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生蔣超、梅淼，俄亥俄州大學(xué)博士后李斌、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士生朱修銳為共同第一作者。清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的郭永課題組也有重要貢獻(xiàn)。該工作得到了科技部重點研發(fā)計劃，中組部青年千人計劃，生命科學(xué)聯(lián)合中心和美國蓋茨基金會的資助。